(一)VE Elisa Kit透射光免疫浊度技术
透射光免疫浊度技术是一种极为简单的方法,测量方式是测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减,读数以吸光度A(或光密度OD)表示,A值反映了入射光强度和透射光强度的关系。免疫复合物直径为35-lOOnm,这一范围要求近紫外光处入射光发出zui大的干扰(zui大吸收峰),选择290-410nm波长测。由于抗原抗体结合后在短时间内(<19s)只能形成小复合物,无法进行比浊,需要等几分钟到数小时(>19s)形成可见的复合物,才能进行比浊。为了提高复合物形成速度,加入促聚剂,如4%聚乙二醇(MW:6 000~8 000),可使复合物形成在3—10rain完成。
(二)终点散射比浊技术
终点法是指在抗原抗体结合完成后进行免疫复合物的定性或定量测定。散射比浊应用越来越多,且有替代其他免疫定量法的趋势。散射比浊的原理是依据雷利(Rayleigh)公式提出的,当复合物较小时(<3×106Dal)(1Dal≈1u),呈全透射,透射与散射相当。当复合物大于入射光波长的l/20时,形成不对称的前向散射,在900以前的角度测量散射光皆可取得好的效果,散射光的量代表复合物的量。散射比浊测定法是在光路的50~900角方向上测定散射光的强度。VE Elisa Kit复合物的粒子随散射角度而异,大的散射光角度适于35一lOOnm的微粒,较小的散射光角度适于100—800nm的微粒测定。散射比浊法在许多自动化仪器上皆有测试程序,大多为终点法,该法稳定性好。
(三)速率散射比浊技术
所谓速率,是在某一单位时间内形成大于3×106Dal(1Dal≈lu)以上的复合物量(不是积累数),当仪器测定到某一单位时间内形成的速率下降时,即出现速率峰,该峰值的高低,即代表抗原的量。该技术有3大特点:①时间快,一般在30~60s就可完成测试;②准确,因其只测定形成速率,抗原越多速率越快;③节省试剂。此外,速率法的灵敏度与特异性都优于终点法,前者的灵敏度比后者高出3个数量级之多。
(四)粒子强化免疫浊度测定技术
粒子强化免疫浊度测定技术的基本原理是选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒,吸附或交联抗体后,当遇到相应抗原时,则发生聚集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内,光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时,则使透过光减少,这种减少的程度与胶乳凝集成正比,当然也与待测抗原量成正比。此法灵敏度较高,可达ng/m1或pg/ml水平。该技术的关键在于两个方面:首先是选择适用的胶乳,其大小(直径)要稍小于波长,用500nm波长者选择lOOnm颗粒较适合,用585nm波长者则选用100~200nm颗粒为好,目前多用200nm的胶乳颗粒;其次,胶乳与抗体结合时用化学交联虽好,但失活也较严重,VE Elisa Kit一般用吸附法即可。