胶体金蛋白制备操作方法

1.肺表面活性物质相关蛋白CElisa试剂盒待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。

2.待标胶体金溶液的准备 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时，调至7.6;标记SPA时，调至5.9~6.2;标记ConA时，调至8.0;标记亲和素时，调至9~10。

由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。

3.胶体金与标记蛋白用量之比的确定

(1)根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。

(2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5mg/ml~50mg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。

(3)5min后，在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。

(4)结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过zui低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的zui低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的zui低用量，在实际工作中，可适当增加10%~20%。

4.胶体金与蛋白质(IgG)的结合 将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，肺表面活性物质相关蛋白CElisa试剂盒加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。

5.胶体金标记蛋白的纯化

(1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。

用BSA做稳定剂的胶体金-羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min)20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h;20nm~40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。

为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%~30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

(2)凝胶过滤法:此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5~1/10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG标记物)，流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，肺表面活性物质相关蛋白CElisa试剂盒随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，zui后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。zui终可得到70%~80%的产量。

6.胶体金蛋白结合物的质量鉴定

(1)胶体金颗粒平均直径的测量:用支持膜的镍网(铜网也可)蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。

(2)胶体金溶液的OD520nm值测定:胶体金颗粒在波长510nm~550nm之间出现zui大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA，0.02%NaN3)将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520=0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2~0.4。

(3)金标记蛋白的特异性与敏感性测定:采用微孔滤膜免疫金银染色法(MF-IGSSA)。将可溶性抗原(或抗体)吸附于载体上(滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜)，用胶体金标记的抗体(或抗原)以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。

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