过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRPzui可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。 按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中zui后的酶活性测定，因经过*洗涤，游离酶可被除去，并不影响zui终的显色。ELISA试剂盒但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
ELISA试剂盒中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。诹讲椒ㄖ校?br> 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。ELISA试剂盒也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。