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错配修复基因检测细胞衰老
点击次数:915 更新时间:2016-08-08

错配修复基因超家族属于管家基因,目前已发现人类6个错配修复基因:hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS1和hPMS2。错配修复基因的异常表现为基因突变和蛋白质表达的减步,而蛋白质表达涉及RNA水平和蛋白质水平。下面就RNA水平作一简要阐述。

错配修复基因mRNA原位杂交:

【材料】

盖玻片、湿盒、杂交炉、PBS、SSC、预杂交液、BcIP/NBT。

【操作程序】

1.将细胞制成1~107/L细胞悬液,将细胞悬液一滴接种于已消毒培养皿中的盖玻片上,加培养基培养48小时。

2.将细胞生长状态良好的盖玻片取出0.01mol/L PBS漂洗3次,甲醇:丙酮(1:1)固定液固定10分钟,PBS漂洗3次。

3.将制好的细胞片用10mg/ml蛋白酶K消化,37℃,10分钟,PBS洗2次,每次2分钟。

4.取200μl预杂交液95℃变性10分钟,冰浴中骤冷,加样于细胞标本上.平放入密封湿盒.42℃孵育3小时。

5.标记探针加于200μl预杂交液中,95℃变性10分钟,冰浴中骤冷,加样于细胞标本上,平放入密封湿盒,42℃恒温过夜。

6.依次用6 xSSC-45%甲酰胺洗10分钟,2×SSC洗10分钟×2次,0.2xSSC洗10分钟×2次。

7.加碱性磷酸酶标记的抗体,37℃,4小时。

8.洗脱液洗10分钟,加入BCIP/NBT显色。镜检显况,PBS冲洗,终止显色。

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