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改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体
点击次数:1300 更新时间:2016-02-19

改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体

HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基,再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基发生自身偶联,在标记前先用2,4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。酶与抗体的结合反应后,再加入硼氢化钠还原成稳定的结合物。

(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L,pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中,加入1%DNFB无水乙醇溶液0.1ml,室温下轻微搅拌1h;

(2) 加入新鲜配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml,此时溶液由原棕色变为墨绿色,置4℃放置30min,此时溶液由原棕色变为墨绿色;

(3) 加入2.5%乙二醇1ml, 室温下轻微搅拌1h,终止反应;

(4) 加入待标记的抗体5-10mg, 用1.0mol/L, pH9.5 C,调节pH值至9.0;

(5) 混匀,置4℃过夜

(6) 加入硼氢化钠溶液0.1ml,混匀,4℃放置3h;

(7) 对0.01mol/L,pH7.4 ,4℃透析过夜,换液3次;

(8) 3000r/min离心30min,去除沉淀物;

(9) 收集上清液即为酶标记抗体

【注意事项】

(1) 在氧化HRP时,以pH5.6醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。

(2) 一般认为氧化HRP 5mg, NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml为宜,不能低于0.015mol/L 0.5ml。

(3) 氧化HRP时间以15-30min为宜。

(4) 加入DNFB的目的是为了封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。

(5) 加入乙二醇的目的是终止反应;为便于在加入抗体后调pH值,故乙二醇要用0.05mol/L C配制。

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