兔主动脉平滑肌细胞培养血管壁可分为内膜、中膜与外膜三层。内膜由内皮、内皮下层和内弹性膜组成；中膜由平滑肌、弹性纤维和胶原纤维组成；外膜为结缔组织，与周围的结缔组织相连。除去血管内膜和外膜后，即为血管平滑肌细胞层。体外培养可使平滑肌细胞持续存活与生长，并保持血管平滑肌细胞在体的某些特性，便于研究。本节以兔主动脉平滑肌细胞为例介绍培养法。

一、材料与试剂

(一)材料

动物家兔(大鼠、猪等动物亦可)。

(二)培养液与试剂

1．MEM培养液添加水解乳蛋白、、小牛血清(原代培养时加20％，传代培养时加10％)，(100IU／ml)和(100μg／ml)，以NaHCO3溶液调pH至7．2。

2．Hanks液

3．消化液0．15％；0．2％胶原酶；0．15％胰蛋白与O．020%EDTA等量混合液。

4．培养皿、培养瓶及手术器具等。

二、培养方法

(一)动脉血管壁中膜的制备

1．将家兔乙醚麻醉后固定，乙醇消毒胸腹部，沿胸骨切开胸腔，找到主动脉，两端结扎，无菌切下主动脉血管．放入含有Hanks液的平皿中。

2．将取下的血管用Hanks液反复洗净血污后放人含培养液平皿中。

3．将洗净动脉切成2．5～3．0cm长的小段并剥离外膜。用两个镊子在动脉段的一端撕开外膜，用组织镊夹住中膜，用带钩镊子夹住外膜向另一端撕拉，使外膜呈现套袖状剥下。

4．剪取镊子夹过的中膜，将动脉纵行剪开，使内膜朝上平摊于小木块上，以圆钝的镊子或剪刀背轻轻刮去内皮细胞。

5．将剥去内、外膜的中膜在培养液中洗净，平铺在另一小木块上，用刀片切成1mm3大小的组织块，即为平滑肌组织。

(二)分散细胞与原代培养

1．将动脉中层组织块置于小三角烧瓶(或小瓶)中，加入O．2％胶原酶溶液，盖上盖，在37℃恒温箱中作用1～3h，至组织呈絮状。

2．再加入O．15％溶液，于37℃磁力搅拌下消化5～10min。吸取分散的细胞，即为平滑肌细胞。如还有组织块，可用溶液再消化1次。

3．将所得的全部细胞悬液吸入刻度离心管中，加含10％小牛血清的培养液以终止消化。1000～1500r／min离心5min，弃去上清液。

4．将细胞沉淀加入含20％小牛血清的培养液中，调制成浓度为l～5×105个／ml的细胞悬液，接种于培养瓶中。

5．37℃、C02培养箱中培养，逐日观察，每3d换液1次。

(三)传代细胞培养

当原代细胞生长至融合并形成单层细胞时即可传代培养。

1．倾去培养液，以Hanks液洗涤瓶壁上的细胞2次。

2．加入O．15％与0．02％EDTA混合消化液，覆盖细胞表面即可。室温下作用2min并用倒置(或相差)显微镜观察，可见大部分细胞变圆，边缘清楚，此时翻转培养瓶停止消化。

3．倒去消化液，加入含10%小牛血清的培养液以终止消化。用吸管吹打(或用带胶皮的弯头滴管将细胞从瓶壁上刮下再吹打)分散细胞，制成细胞悬液。调制细胞浓度为l～5×105个／ml。

4．接种到新的培养瓶中，并补充含10％小牛血清的培养液进行培养。细胞长满成层后，又可依同法传代。

(四)细胞同步培养法

当常规培养的平滑肌细胞转入低血清培养液中培养2～3d后，细胞大多能停留在细胞周期的G0期，基本达到同步化效果。具体方法：

1．倾去常规培养的培养液，并用Hanks液洗涤3次。

2．加入含O．5％小牛血清的培养液，于37℃下维持培养2～3d，可使细胞基本上同步于G0期。

3．当转入含10％血清培养液中培养12h时，平滑肌细胞会再次同步进入DNA合成期。

(五)平滑肌细胞玻片培养法

将小方瓶(或培养皿)内预先放人盖玻片，将平滑肌细胞悬液接种其上，待生长成单层细胞后取出盖玻片，用于染色、制电镜标本等。

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