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兔主动脉平滑肌细胞培养
点击次数:1077 更新时间:2016-01-18

兔主动脉平滑肌细胞培养血管壁可分为内膜、中膜与外膜三层。内膜由内皮、内皮下层和内弹性膜组成;中膜由平滑肌、弹性纤维和胶原纤维组成;外膜为结缔组织,与周围的结缔组织相连。除去血管内膜和外膜后,即为血管平滑肌细胞层。体外培养可使平滑肌细胞持续存活与生长,并保持血管平滑肌细胞在体的某些特性,便于研究。本节以兔主动脉平滑肌细胞为例介绍培养法。

一、材料与试剂

(一)材料

动物家兔(大鼠、猪等动物亦可)。

(二)培养液与试剂

1.MEM培养液添加水解乳蛋白、、小牛血清(原代培养时加20%,传代培养时加10%),(100IU/ml)和(100μg/ml),以NaHCO3溶液调pH至7.2。

2.Hanks液

3.消化液0.15%;0.2%胶原酶;0.15%胰蛋白与O.020%EDTA等量混合液。

4.培养皿、培养瓶及手术器具等。

二、培养方法

(一)动脉血管壁中膜的制备

1.将家兔乙醚麻醉后固定,乙醇消毒胸腹部,沿胸骨切开胸腔,找到主动脉,两端结扎,无菌切下主动脉血管.放入含有Hanks液的平皿中。

2.将取下的血管用Hanks液反复洗净血污后放人含培养液平皿中。

3.将洗净动脉切成2.5~3.0cm长的小段并剥离外膜。用两个镊子在动脉段的一端撕开外膜,用组织镊夹住中膜,用带钩镊子夹住外膜向另一端撕拉,使外膜呈现套袖状剥下。

4.剪取镊子夹过的中膜,将动脉纵行剪开,使内膜朝上平摊于小木块上,以圆钝的镊子或剪刀背轻轻刮去内皮细胞。

5.将剥去内、外膜的中膜在培养液中洗净,平铺在另一小木块上,用刀片切成1mm3大小的组织块,即为平滑肌组织。

(二)分散细胞与原代培养

1.将动脉中层组织块置于小三角烧瓶(或小瓶)中,加入O.2%胶原酶溶液,盖上盖,在37℃恒温箱中作用1~3h,至组织呈絮状。

2.再加入O.15%溶液,于37℃磁力搅拌下消化5~10min。吸取分散的细胞,即为平滑肌细胞。如还有组织块,可用溶液再消化1次。

3.将所得的全部细胞悬液吸入刻度离心管中,加含10%小牛血清的培养液以终止消化。1000~1500r/min离心5min,弃去上清液。

4.将细胞沉淀加入含20%小牛血清的培养液中,调制成浓度为l~5×105个/ml的细胞悬液,接种于培养瓶中。

5.37℃、C02培养箱中培养,逐日观察,每3d换液1次。

(三)传代细胞培养

当原代细胞生长至融合并形成单层细胞时即可传代培养。

1.倾去培养液,以Hanks液洗涤瓶壁上的细胞2次。

2.加入O.15%与0.02%EDTA混合消化液,覆盖细胞表面即可。室温下作用2min并用倒置(或相差)显微镜观察,可见大部分细胞变圆,边缘清楚,此时翻转培养瓶停止消化。

3.倒去消化液,加入含10%小牛血清的培养液以终止消化。用吸管吹打(或用带胶皮的弯头滴管将细胞从瓶壁上刮下再吹打)分散细胞,制成细胞悬液。调制细胞浓度为l~5×105个/ml。

4.接种到新的培养瓶中,并补充含10%小牛血清的培养液进行培养。细胞长满成层后,又可依同法传代。

(四)细胞同步培养法

当常规培养的平滑肌细胞转入低血清培养液中培养2~3d后,细胞大多能停留在细胞周期的G0期,基本达到同步化效果。具体方法:

1.倾去常规培养的培养液,并用Hanks液洗涤3次。

2.加入含O.5%小牛血清的培养液,于37℃下维持培养2~3d,可使细胞基本上同步于G0期。

3.当转入含10%血清培养液中培养12h时,平滑肌细胞会再次同步进入DNA合成期。

(五)平滑肌细胞玻片培养法

将小方瓶(或培养皿)内预先放人盖玻片,将平滑肌细胞悬液接种其上,待生长成单层细胞后取出盖玻片,用于染色、制电镜标本等。

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