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IL-3 鸡白介素3酶联免疫试剂盒分光光度法
点击次数:351 更新时间:2022-07-20

  为了更好的使用elisa试剂盒,接下来为大家说一下elisa试剂盒的提纯方法,希望以下介绍对大家有所帮助。

IL-3 鸡白介素3酶联免疫试剂盒分光光度法注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 试剂一:液体×1瓶,4℃保存。 试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。 试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一,沸水溶解。试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加50mL蒸馏水溶解。试剂五:液体×1瓶,4℃保存。 标准品:液体×1支,0.25μmol/mL标准酪an酸溶液,4℃保存。自备仪器和用品: 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5mLEP管和蒸馏水。产品说明: NP在一定的温度和中性pH条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋bai酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品。 中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪an酸;在碱性条件下,酪an酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。

操作过程:

一、粗酶液提取:

1.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。2.血清或培养液:直接测定。 3.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

二、测定操作: 1.分光光度计预热30min,调节波长到680nm,蒸馏水调零。2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。 3.对照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂三,混匀后8000g,4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A对照管。 4.测定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂二,混匀后8000g,4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二) 5.空白管:取EP管,加入200μL蒸馏水,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A空白管。 6.标准管:取EP管,加入200μL标准品,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A标准管。注意:空白管和标准管只需要测定一次。

NP酶活性计算:

(1)按蛋白浓度计算 NP活性单位(U)定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1μmol酪an酸为一个酶活单位。NP活性(U/mgprot)=C标准品×△A测定÷△A标准×V1÷(Cpr×V2)÷T =0.125×△A测定÷△A标准÷Cpr

(2)按样本鲜重计算 NP活性单位(U)定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1μmol酪an酸为一个酶活单位。NP活性(U/g鲜重)=C标准品×△A测定÷△A标准×V1÷(W×V2÷V3)÷T =0.125×△A测定÷△A标准÷WC标准品:标准酪an酸溶液浓度,0.25μmol/mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL;W:样品鲜重,g; V1:酶促反应总体积,0.1mL;V2:加入反应体系中粗酶液体积,20µL=2×10-2mL;V3:粗酶液总体积,1mL; T:催化反应时间,10min。 注意:若反应较弱,(A测定管-A对照管)差值较小,可适当延长反应时间(20-30min),即第一步水浴时间,最后计算酶活时对公式进行修改。


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